摘 要：建立了一种在线超临界萃取、超临界色谱和质谱联用相结合的检测分析方法。方法取3mm的干斑置于提取器中，上样分析。结果测定6种毒物的线性范围在10～1000ng/mL，回收率均在68.8～110.2之间，检出限在1～10ng/mL之间。整个方法具有简便，快速，准确、灵敏度高等特点，为检验血中的毒物提供了一种全新的分析方法。
关键词：超临界萃取超临界色谱血毒物

超临界萃取(SupercriticalFluidExtraction，SFE)是一种物理分离和纯化的方法，利用压力和温度对CO₂超临界流体溶解能力的影响而进行的，其萃取过程由萃取和分离过程组合而成。在超临界状态下，将CO₂与待分离的物质接触，使其按照沸点高低、极性大小、和分子量大小将成分依次萃取出来。对应各压力范围所得到的萃取物不是绝对单一的，但可以通过控制条件得到最理想比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的。目前，超临界萃取和超临界色谱技术在天然药物提取、环境保护等领域的应用已有报道，但在血液中的毒物分析检测报道较少。本研究通过超临界萃取仪、超临界色谱和质谱联用相结合，通过对超临界萃取条件进行了摸索，建立了一种全新的在线萃取和液质联用相结合的毒物分析方法。通过改变超临界萃取的条件，摸索出血液中地西泮、阿普唑仑、三唑仑、艾司唑仑、硝基西泮和氯硝西泮6种安眠类药物的最佳分析方法。该方法具有操作简便、快速、样品处理简单、灵敏度高、重现性好等优点。
1、材料与方法
1.1、试剂和材料
标准对照品：地西泮(diazepam)、阿普唑仑(alprazolam)、三唑仑(triazolam)、艾司唑仑(estazolam)、硝基西泮(nitrazepam)、氯硝西泮(clonazepam)购自公安部物证鉴定中心。以上纯品均用甲醇配制成1mg/mL 的标准溶液。Whatman 903 DBS 卡购自T通用电气医疗集团。
Nexera UC 在线超临界萃取-超临界色谱仪(岛津)；LCMS-8040 三重四极杆质谱仪(岛津)。
1.2、半岛游戏平台官网入口网址 条件
1.2.1、超临界萃取条件
1.2.2、超临界色谱-串联质谱仪条件
色谱柱为岛津GL公司色谱柱(Inetersil SIL 4.6 mm I.D.×150 mmL.，5 μm)；柱温：40℃；流动相A：CO₂；流动相B(改性剂)：甲醇；流速：3 mL/min；萃取及洗脱程序见表1。

表1 流动相和梯度洗脱条件

Time	Module	Commond	Value
2.00	SFE	Extraction Valve	Dynamic
4.00	SFE	End
4.00	Pumps	Pump B Conc.	10
4.01	Pumps	Pump B Conc.	20
10.00	Pumps	Pump B Conc.	20
18.00	Pumps	Pump B Conc.	100
20.01	Pumps	Pump B Conc.	100
20.01	SFE	Wash
20.02	Pumps	Shut Off Valve(Pump A)	Close
21.99	Pumps	Pump B Conc.	100
22.00	Pumps	Pump B Conc.	0
22.00	Pumps	Total Flow	3
22.01	Pumps	Total Flow	0
22.02	Pumps	Shut Off Valve(Pump A)	Open
22.49	Pumps	Shut Off Valve(Pump A)	Open(Pump On)
22.50	SFE	Extraction Valve	Static
22.50	Pumps	Total Flow	0
22.51	Pumps	Total Flow	3
22.51	SFE	Vent Valve	Vent
25.50	Controller	Stop

质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式；雾化气流速：3.0 L/min；干燥器流速：15 L/min；DL温度：200℃；加热模块温度：400℃；MRM 参数见表2。

表2 监测离子对和碰撞能

名称	保留时间（min）	定量离子对	定性离子对	碰撞能量（eV） 定量/定性
地西泮	5.550	285.10 > 193.10	285.10 > 154.10	-32/-28
硝西泮	6.353	282.05 > 236.10	282.05 > 207.25	-24/-35
氯硝西泮	6.474	316.00 > 270.05	316.00 > 241.05	-25/-37
艾司唑仑	9.408	295.10 > 267.05	295.10 > 267.05	-25/-45
阿普唑仑	10.231	309.10 > 205.10	309.10 > 281.00	-45/-25
三唑仑	10.902	343.00 > 308.05	343.00 > 238.90	-28/-35

1.3、样品处理
标准品的制备：将1000 ng/mL 的标准混合液，使用甲醇稀释至500、200、100、50、10 ng/mL的标准溶液，用于校准曲线的制作。每份标准溶液取20μL 点样到Whatman 903 DBS 卡上。室温晾干后打孔取直径3 mm 的干斑置于提取器中，上样分析。
样品的制备：取20 μL 人血点样到Whatman 903 DBS 卡上，室温晾干后打孔取直径3 mm 的干斑置于提取器中，上样分析。
2、结果与讨论
2.1、超临界萃取条件的优化
试验以萃取改性剂的用量、萃取压力和萃取温度为变量，以目标物的峰面积为评价萃取效率的优劣。
2.1.1、萃取改性剂的选择
由于目标物质极性较大，仅使用弱极性的CO₂很难将目标物质提取出来，因此，加入适量的改性剂是首要选择。本试验使用甲醇作为改性剂，考察了甲醇的用量为5%、10%和15%对提取量的影响。结果显示10%的用量最佳。甲醇用量与目标毒物峰面积关系如图所示。

2.1.2、萃取压力的选择
肖观秀等在研究超临界萃取生物碱时发现，适当提高萃取压力能显著提高超临界流体的溶解能力。本试验中考察了10 MPa、20 Mp 和30 MPa 萃取压力下，6 种毒物的峰面积。结果发现，当萃取压力从10 MPa 增加到15 MPa 时，提取效率有明显的提高，所有毒物的峰面积明显提高，有些甚至提高了2-3 倍。当继续提高提取压力到20 MPa 时，艾司唑仑、阿普唑仑和三唑仑的峰面积继续增加；而其他毒物的呈现下降趋势，不过下降的不是非常的明显。

2.1.3、萃取温度的选择
在其他条件不变情况下，考察了萃取温度对血中毒物的萃取能力。从图萃取温度对峰面积的曲线可以看出，存在最佳的萃取温度。且，从图中明显看出，对于多数毒物，当萃取温度达到60℃时，峰面积最小。

2.2、MRM 色谱图
200 ng/mL 人血加标样品的色谱图如下图所示，6种毒物得到了较好的分离。使用在线SFE-SFC系统，从提取到分离分析仅需要25分钟。大大节省了整个分析周期。

2.3、检出限、线性范围和回收率
用所建立的方法进行了一些分析物定量分析的线性关系和回收率的考察。分别在 DBS 卡上加入不同浓度的标准溶液进行分析，将分析物色谱峰面积比与浓度进行回归，得线性方程及相关系数见表3。测试200 ng/mL 浓度的人血加标样品，平行测定3次，取平均值作为回收率结果，同时计算3次样品的相对标准偏差作为精密度评价，以上实验结果一并列入表3中。根据分析物峰高与含量成正比，计算出分析物色谱峰高相当于基线噪音强度三倍检材中分析物浓度。各药物的检出限(S/N=3)在1～10 ng/mL 之间。

表1 6 种常见镇静药物的线性关系和回收率

药物组分	tR(min)	线性范围 (ng/mL)	相关系数 (R2)	LOD (ng/mL)	回收率 (%)	RSD (%，n=3)
地西泮	5.338	10～500	0.994	2	99.1	13.6
硝西泮	6.458	50～1000	0.992	8	110.2	15.4
氯硝西泮	6.574	50～1000	0.996	8	94.4	20.2
艾司唑仑	9.962	10～500	0.999	1	78	16.7
阿普唑仑	10.828	10～500	0.996	1	107.9	18.8
三唑仑	11.733	50～1000	0.992	10	68.8	18.4

3、小结
本文建立了使用超临界萃取-超临界色谱质谱在线提取和分析人血中的6种安眠类的方法。该方法具有自动化程度高、提取时间短、样品用量少、环境污染小等优点，操作省时省力，而且该方法对分析人员的要求较低、精密度、检出限等各项方法学指标均符合法庭科学毒物分析的要求，为检验血中的毒物分析检测提供了一种全新的快速提取分析方法。